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表面微生物采樣法效果比較——接觸皿法、淋洗法、試子法

發布時間:2019-11-25    瀏覽次數:328

在微生物控制中,表面微生物總數可以作為評估生產過程中微生物污染風險的級別。微生物采樣涉及醫療、食品衛生、制藥工業、航空航天等各個領域,而物體表面微生物采樣更是其中極重要的一個方面表面微生物取樣相對比較困難,微生物附著在物體表面上,如果微生物采樣方法不適合,很難檢測到實際微生物數量。在實際微生物采樣過程中物體表面的材質和粗糙度都有所不同,不同的污染媒介和微生物都會影響采樣結果。

拭子采樣法于 1997 年被作為定量和半定量表面微生物采樣的標準方法,主要借助消毒拭子擦拭待檢測表面,再轉移到培養皿中進行培養;而新版 GMP 和藥典中均提及接觸皿采樣法可作為表面微生物采樣方法,本研究通過接觸皿采樣法、拭子采樣法、淋洗采樣法進行比較,評估了各采樣法的采樣效果,為接觸皿采樣法的應用提供借鑒。

材料與方法

1. 所需材料、試劑及儀器

金黃色葡萄球菌 ATCC6538

大腸埃希菌ATCC25922

枯草芽胞桿菌ATCC6633

銅綠假單胞菌 ATCC9027  

白色念珠菌ATCC10231

黑曲霉 ATCC16404

型培養箱、型菌落計數儀

316L 型不銹鋼板

接觸皿

胰酪大豆胨瓊脂培養基( TSA)接觸皿; 

沙氏葡萄糖瓊脂培養基( SDA) 接觸皿; 

營養瓊脂培養基( NA) 接觸皿

PH = 7.0 氯化鈉蛋白胨緩沖液

2. 方法

2.1  菌懸液配制 

接種金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、枯草芽胞桿菌至胰酪 TSA 培養基斜面中,于 30 ℃ ~ 35 ℃ 培養 18 h ~ 24 h; 接種黑曲霉、白色念珠菌至 SDA 培養基斜面中,于 23 ℃ ~ 28 ℃培養 48 h ~72 h,上述培養物用 0.9% 無菌氯化鈉溶液制成每0. 1 ml含菌數分別為1 cfu ~ 10 cfu 的低濃度菌懸液和50 cfu ~ 100 cfu 的高濃度菌懸液,并在 24 h 內使用。

2.2 菌種載體的制備 

取面積為 25 cm2 的 316L不銹鋼板作為載體。載體于染菌前,應進行脫脂和滅菌處理。采用濕熱滅菌法( 121 ℃,30 min) 對經過脫脂處理后的載體進行滅菌處理。將經滅菌的載體平鋪于無菌平皿內,逐片滴加菌液,菌液滴加量每片為0.1 ml,將菌液均勻擦拭整個載體表面,滴染菌液后于層流臺下吹干。

2.3 具體操作

將制備后的菌種載體分為 2 組,每組 3 片 ~ 5 片,分為取樣檢測組和實際活菌檢測組,同時另取 3 片未染菌的載體做為陰性對照組。


取樣檢測組: 使用待評估的微生物取樣方法對菌種載體微生物進行采樣,制備供試液后檢測各菌種載體上活菌數。

實際活菌檢測組: 將菌種載體放入裝有 100 ml 生理鹽水的燒杯中,使用漩渦振蕩器振蕩 3 min 后,取出燒杯中的生理鹽水作為供試液,采用薄膜過濾法在TSA( 細菌) 或 SDA( 霉菌) 90mm 平板培養基上培養,檢測菌種載體上菌落數; 分別對 3 個菌種載體進行檢測,以3 次檢測結果的平均值作為菌種載體的實際活菌數。

陰性對照組: 將未染菌的載體放入裝有 100 ml 生理鹽水的燒杯中,使用漩渦振蕩器振蕩 3 min 后,取出燒杯中的生理鹽水作為供試液,采用薄膜過濾法分別在 TSA及SDA90mm 平板培養基上培養,進行活菌計數,以 3 片未染菌的載體計數結果的平均值作為陰性對照結果。

接觸皿采樣法:

TSA、NA 和SDA 培養基接觸皿( φ55 mm,面積為25 cm2 ) ,取下皿蓋將培養基凸起面按壓到采樣物體表面5 s ~ 10 s 后,將皿拿起蓋好皿蓋,細菌置于30 ℃ ~ 35 ℃培養48 h,真菌于23 ℃ ~28 ℃培養72 h 觀察計數。TSA 接觸皿測試菌種為金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、枯草芽胞桿菌、黑曲霉、白色念珠菌; NA 接觸皿測試菌種為金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、枯草芽胞桿菌; SDA 接觸皿測試菌種為黑曲霉、白色念珠菌。

淋洗采樣法:

將20 ml 生理鹽水緩緩傾注到裝有菌種載體的平皿中,傾注時注意液體傾注點處于菌種載體中心位置,全部傾注后,將無菌平皿輕輕向上下左右各晃動5 次,晃動幅度大概在2 cm ~3 cm,之后使用移液槍將平皿中的生理鹽水全部取出,作為供試液,取10 ml 進行活菌計數,采用薄膜過濾法,濾干后取出濾膜,細菌濾面朝上貼于TSA 90mm平板培養基和NA 90mm平板培養基上,真菌濾面朝上貼于SDA90mm平板培養基上,細菌置于30 ℃ ~ 35 ℃培養48 h,真菌于23 ℃ ~ 28 ℃培養72 h 觀察計數。計數結果的2倍為淋洗取樣活菌計數結果。

拭子采樣法:

取無菌拭子,用無菌的0. 9%氯化鈉溶液5 ml 浸濕,在取樣點處選擇約為25 cm2取樣面上擦拭,完成后迅速將拭子放入無菌試管中并密封,加入10 ml 0. 9% 生理鹽水,使用旋渦振蕩器充分振蕩后作為供試液,取5 ml 進行活菌計數采用薄膜過濾法過濾,濾干后取出濾膜,細菌濾面朝上貼于TSA90mm平板培養基和NA 90mm平板培養基上,真菌濾面朝上貼于SDA90mm 平板培養基上,細菌置于30 ℃ ~ 35 ℃ 培養48 h,真菌于23 ℃ ~ 28 ℃培養72 h 觀察計數。計數結果的2 倍為擦拭取樣活菌計數結果。

通過統計學處理,回收率以3 次實驗測試值的平均值計,標準要求: 回收率≥70%。

結果

低含菌量和高含菌量的載體上TSA 接觸皿、NA接觸皿、SDA 接觸皿采樣,與淋洗采樣和拭子采樣比較,回收率差異均無統計學意義( P > 0. 05) 。接觸皿采樣、淋洗采樣、拭子采樣在低含菌量( 1 cfu /25 cm2 ~ 10 cfu /25 cm2 ) 的物體表面的采樣回收率高于在高含菌量( 50 cfu /25 cm2 ~100 cfu /25 cm2 ) 的物體表面的采樣回收率,但均能達到70%以上。

結論

在食品藥品企業生產車間,生產工具、儀器設備表面的微生物含量直接影響產品的最終質量,拭子采樣法是一種較早用于表面微生物檢測的方法,但是由于拭子檢測法需要將拭子上的微生物轉移至培養基中,不僅增加了檢測步驟,而且容易在轉移過程中產生假陽性。接觸皿采樣法作為一種表面微生物檢測方法,不僅便于使用節省人力且對使用條件要求較低,例如不需要高壓滅菌鍋、超凈臺等,因此接觸皿用于表面微生物的檢測更加方便快捷。

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